熒光顯微鏡相比普通光學(xué)顯微鏡有高特異性、高靈敏度等優(yōu)勢，是現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室必不可少的工具，而使用熒光顯微鏡成像拍照，怕的就是出現(xiàn)高強(qiáng)度的熒光染色背景，因?yàn)檫@會降低成像信噪比，導(dǎo)致樣品信號不清晰、細(xì)節(jié)丟失。那么熒光染色背景太強(qiáng)有哪些成因呢？又如何避免呢？

一、環(huán)境光導(dǎo)致的背景熒光

陽光是非常大影響的環(huán)境光環(huán)境光導(dǎo)致熒光顯微鏡背景熒光增強(qiáng)是很常見的情況，因?yàn)榄h(huán)境光沒有經(jīng)過激發(fā)濾光片的過濾，所以有可能包含激發(fā)光在內(nèi)的各種波長光，這可能會帶來額外的背景熒光和雜散光。暗室成像可降低背景熒光很多老師會用暗室成像，或用衣服/遮光罩把熒光顯微鏡遮光來成像，這對降低一些背景熒光和雜散光是有意義的，有條件可以參考。

二、透射聚光鏡導(dǎo)致的背景熒光

激發(fā)光照亮了下光源，帶來背景熒光目前使用的熒光顯微鏡主要是落射熒光顯微鏡，也就是說，熒光激發(fā)光從物鏡出來，照射樣品，然后發(fā)射光回到物鏡成像。由于樣品玻片是透明的，因此激發(fā)光穿過樣品后還會進(jìn)入透射光路的聚光鏡，再反射并聚光回樣品上，形成強(qiáng)背景熒光。

倒置熒光顯微鏡我們以升級熒光觀察的正置顯微鏡和倒置顯微鏡為例，給大家介紹如何解決這個問題。調(diào)整聚光鏡前的背景熒光（目鏡成像）首先是正置熒光顯微鏡，在進(jìn)行調(diào)整前，有非常強(qiáng)的同色背景熒光，導(dǎo)致樣品信號比較難分辨。聚光鏡有限位要先解鎖首先下調(diào)聚光鏡高度，部分機(jī)子可能有限位裝置，需要先解除限位再下降。把聚光鏡光闌收到小，或把黑卡紙、牛皮紙之類不反光的紙片，插到聚光鏡頂部和載物臺之間。調(diào)整聚光鏡后的背景熒光（目鏡成像）可以看到背景熒光得到了大幅改善，這個信噪比足夠后期把背景熒光處理掉了。調(diào)整聚光鏡前的背景熒光（目鏡成像）倒置熒光顯微鏡方面，在進(jìn)行調(diào)整前，有偏紅的背景熒光和雜散光出現(xiàn)，影響成像純凈度。聚光鏡孔徑光闌收到小由于倒置顯微鏡無法調(diào)節(jié)工作高度，也不方便放置遮光板，因此可以做簡單的操作，把聚光鏡的孔徑光闌收到小，光闌的葉片會阻擋發(fā)射光透過，就避免了額外的背景熒光。調(diào)整聚光鏡后的背景熒光（目鏡成像）孔徑光闌收小之后，偏紅的背景熒光就消失了，樣品信噪比得到了改善。

三、來自樣品、器皿和介質(zhì)的背景熒光

上述兩種背景熒光，都不會因?yàn)闃悠芬苿佣兓绻麡悠芬苿颖尘盁晒庖灿凶儎?，那么問題可能就出在樣品、器皿或者介質(zhì)，需要針對性處理。微管中未結(jié)合的染料比如樣品有未結(jié)合的染料，需測試優(yōu)化合適的熒光染料濃度，并在樣品處理時使用PBS多漂洗幾次，去除未結(jié)合的染料。熒光染料和植物自發(fā)熒光一同激發(fā)如果樣品有自發(fā)熒光造成干擾，可能需要嘗試其他通道的染料進(jìn)行標(biāo)記，另外塑料器皿也可能有背景熒光，建議使用無熒光的玻璃器皿。觀察多孔板，塑料有背景熒光如果使用多孔板，可以設(shè)置一些不帶樣品的對照孔來獲取背景熒光強(qiáng)度信息，方便后期處理時可以把背景熒光扣除掉。

免疫熒光標(biāo)記的固定細(xì)胞成像，如果出現(xiàn)背景熒光問題，需要檢查封片劑，高倍觀察的話還要注意鏡油是否為無熒光鏡油。

好了，以上就是本期對熒光顯微鏡成像背景熒光強(qiáng)的成因和一些解決方法的介紹，希望對大家的日常實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室管理有幫助。