光學(xué)顯微鏡的相差觀察方法（Phase Contrast）是一種利用光的干涉原理來增強(qiáng)樣品與背景之間對(duì)比度的觀察技術(shù)。以下是對(duì)光學(xué)顯微鏡相差法觀察方法的詳細(xì)介紹：

一、成像原理

人眼只能在光波的波長(zhǎng)（顏色）和振幅（亮度）有變化的情況下區(qū)分被檢物體。對(duì)于和周圍介質(zhì)折射率相差不大的透明狀物體，如活細(xì)胞、微生物等，光線通過時(shí)波長(zhǎng)和振幅變化不顯著，難以分辨。相差觀察方法利用樣品的厚度和折射率引起的相位差，通過光學(xué)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)換，將這個(gè)相位差轉(zhuǎn)換成振幅差（即亮度差），從而提高樣品的可見度和對(duì)比度。

具體來說，當(dāng)光線通過樣品時(shí)，由于樣品不同部分的折射率不同，光線會(huì)發(fā)生不同程度的折射和相位延遲。這些相位差異在通過相差物鏡和相差聚光鏡時(shí)，會(huì)被轉(zhuǎn)換成振幅差異，使得樣品的不同部分在視野中呈現(xiàn)出不同的亮度，從而提高了樣品的清晰度和可見度。

二、關(guān)鍵部件

相差觀察方法需要以下關(guān)鍵部件：

相差聚光鏡：在光源與聚光鏡之間加入相差環(huán)（環(huán)形光闌），使透過聚光鏡的光線形成環(huán)形光。相差環(huán)的環(huán)狀孔直徑和孔寬與物鏡內(nèi)的相位環(huán)板匹配，形成的像恰好落在物鏡后焦面與相位板上的共軛面重合。因此，不同倍數(shù)物鏡要與不同倍數(shù)的環(huán)匹配。相差環(huán)可通過推拉環(huán)板、轉(zhuǎn)盤聚光鏡等形式切換進(jìn)出光路。

相差物鏡：相差物鏡鏡片中裝有相位板，這個(gè)相位板通常由氟化鎂等材料制成，能夠?qū)⒅鄙涔饣蜓苌涔獾南辔煌七t1/4波長(zhǎng)。根據(jù)相位板的不同設(shè)計(jì)，相差可以分為正相差和負(fù)相差兩種類型。正相差物鏡標(biāo)記為Ph，背景變暗，樣品邊界外圍形成白色光環(huán)；負(fù)相差物鏡標(biāo)記為Nh，背景非常暗，樣品邊界內(nèi)圍形成白色光環(huán)。

三、操作步驟

準(zhǔn)備樣品：將待觀察的樣品放置在載物臺(tái)上，并用壓片夾固定好。

對(duì)光：打開顯微鏡的電源開關(guān)，調(diào)節(jié)光源和聚光鏡，使光線形成環(huán)形光照明。

放置相差物鏡：將相差物鏡安裝在物鏡轉(zhuǎn)換器上，并旋轉(zhuǎn)到工作狀態(tài)。

調(diào)節(jié)焦距：使用粗調(diào)和細(xì)調(diào)螺旋調(diào)節(jié)焦距，使樣品在視野中清晰可見。

觀察：通過目鏡觀察樣品，并調(diào)整光源強(qiáng)度和光圈大小以獲得Z佳的觀察效果。

四、注意事項(xiàng)

選擇合適物鏡和聚光鏡：不同倍數(shù)的物鏡需要配合相應(yīng)倍數(shù)的相差聚光鏡使用，以確保獲得Z佳的相差效果。

保持樣品清潔：樣品表面B須清潔無塵，否則會(huì)影響觀察效果。

調(diào)節(jié)光源強(qiáng)度：光源強(qiáng)度應(yīng)適中，過強(qiáng)或過弱都會(huì)影響觀察效果。

對(duì)中調(diào)節(jié)：相差環(huán)附近通常有對(duì)中螺絲，用于對(duì)中相差環(huán)。未調(diào)中的相差環(huán)會(huì)導(dǎo)致相差效果大打折扣。對(duì)中望遠(yuǎn)鏡（合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡）可用于調(diào)中相襯環(huán)。

五、應(yīng)用

相差觀察方法在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，特別是在細(xì)胞生物學(xué)和微生物學(xué)研究中。相差顯微鏡能夠清晰地觀察到活細(xì)胞、微生物等無色透明樣品的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，為科學(xué)研究提供了有力的支持。

綜上所述，光學(xué)顯微鏡的相差觀察方法是一種利用光的干涉原理來增強(qiáng)樣品與背景之間對(duì)比度的觀察技術(shù)。通過合理配置和使用相差聚光鏡和相差物鏡等關(guān)鍵部件，并遵循正確的操作步驟和注意事項(xiàng)，可以獲得高質(zhì)量的相差圖像。